FastKing RT Twous (Avèk gDNase)

A-1 RNA degrade

——Purifye kalite siperyè RNA ki pa gen okenn kontaminasyon. Materyèl ki soti nan ki RNA ekstrè yo ta dwe fre ke posib yo anpeche degradasyon RNA. Analize entegrite RNA sou jèl denatire anvan reyaksyon RT. Apre ekstraksyon RNA, li ta dwe estoke nan 100% fòmamid. Si yo itilize inibitè RNase, tanperati chofaj la ta dwe <45 ° C, ak pH la ta dwe mwens pase 8.0, otreman inibitè a pral lage tout RNase mare. Anplis, yo ta dwe ajoute inibitè RNase nan solisyon ki gen ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA gen inhibiteurs nan reyaksyon transkripsyon ranvèse

—— Inibitè transkripsyon ranvèse gen ladan SDS, EDTA, gliserin, pirofosfat sodyòm, espèmidin, fòmamid, sèl guanidin, elatriye Melanje RNA kontwòl la ak echantiyon an, epi konpare sede a ak reyaksyon RNA kontwòl la pou tcheke si gen yon inhibitor. Lave presipitasyon RNA ak 70% (v / v) etanòl pou retire inibitè yo.

A-3 ensifizan rkwit nan primè yo itilize pou sentèz premye fil la nan cDNA

——Determine ke tanperati a rkwit apwopriye pou primè yo itilize nan eksperyans la. Pou hexamers o aza, li rekòmande kenbe tanperati a nan 25 ° C pou 10 min anvan yo rive nan tanperati reyaksyon an. Pou primè jèn espesifik (GSP), eseye lòt GSP, oswa chanje a oligo (dT) oswa hexamer o aza.

A-4 Ti kantite kòmanse ARN

—— Ogmante kantite RNA. Pou echantiyon RNA mwens pase 50 ng, 0.1 μg a 0.5 μg acetyl BSA ka itilize nan premye sentèz cDNA

A-5 Sekans sib la pa eksprime nan tisi analize yo.

——Eseye lòt tisi.

A-6 reyaksyon PCR echwe

——Pou de etap RT-PCR, modèl cDNA nan etap PCR la pa ka depase 1/5 volim reyaksyon an.

A-1 ki pa espesifik rkwit nan primè ak modèl

—— 3'-fen nan primè pa ta dwe gen ladan 2-3 dG oswa dC. Sèvi ak Jene-espesifik Jadendanfan nan sentèz la premye strand olye pou yo Jadendanfan o aza oswa oligo (dT). Sèvi ak yon pi wo tanperati rkwit nan premye sik yo kèk, ak Lè sa a, yon tanperati ki pi ba rkwit. Sèvi ak cho-kòmanse Taq ADN polimeraz pou PCR amelyore espesifik nan reyaksyon an.

A-2 Pòv konsepsyon jèn espesifik

——Swiv menm prensip pou anplifikasyon konsepsyon Jadendanfan.

A-3 RNA ki kontamine ak ADN jenomik

—— Trete RNA ak PCN-klas DNase I. Mete kanpe yon reyaksyon kontwòl san yo pa ranvèse transkripsyon yo detekte kontaminasyon ADN.

A-4 Fòme nan dimè Jadendanfan

——Design primer san sekans konplemantè nan fen 3 '.

A-5 Twò wo Mg²⁺ konsantrasyon

——Optimize Mg²⁺ konsantrasyon pou chak modèl ak konbinezon Jadendanfan

A-6 Kontamine ak ADN etranje

—— Sèvi ak konsèy ayewosòl ki reziste ak anzim UDG.

A-1 Kontni an nan pwodwi a premye strand twò wo

—— Diminye kantite pwodwi premye strand nan etap reyaksyon konvansyonèl PCR la.

A-2 Twòp kantite lajan Jadendanfan nan reyaksyon PCR

——Redwi opinyon Jadendanfan.

A-3 Twòp sik

——Optimize kondisyon reyaksyon PCR yo epi redwi kantite sik PCR yo.

A-4 Twò tanperati recuit

—— Ogmante tanperati rkwit pou anpeche inisyasyon ki pa espesifik ak ekstansyon.

A-5 anplifikasyon ki pa espesifik nan fragman oligonukleotid ki te pwodwi pa degradasyon DNase nan ADN - Ekstrè-wo kalite RNA yo anpeche kontaminasyon ADN.

RT-PCR se ranvèse transkri RNA nan cDNA, ak Lè sa a, sèvi ak ranvèse a transkri cDNA kòm yon modèl pou reyaksyon PCR pou anplifye fragman sib la. Chwazi swa primè o aza, Oligo dT ak jèn espesifik primer dapre kondisyon espesifik eksperyans lan. Tout primè ki anwo yo ka itilize pou mRNA selil ekaryotik kout san estrikti epengl.

Jadendanfan Random: Apwopriye pou RNA long ak estrikti epengl, osi byen ke tout kalite RNA tankou rRNA, mRNA, tRNA, elatriye Yo sitou itilize pou reyaksyon RT-PCR nan modèl sèl.

Oligo dT: Apwopriye pou RNA ak ke PolyA (prokaryote RNA, ekaryot Oligo dT rRNA ak tRNA pa gen ke PolyA). Paske Oligo dT mare nan ke PolyA, bon jan kalite echantiyon RNA oblije wo, e menm yon ti kantite degradasyon ap redwi anpil kantite sentèz cDNA plen longè.

Jèn espesifik Jadendanfan: konplemantè nan sekans modèl la, apwopriye pou sitiyasyon kote sekans sib la li te ye.

Gen de fason:

1. Entèn referans metòd: Nan teyori, cDNA se fragman ADN nan longè diferan, se konsa rezilta nan elektwoforèz se fwotman. Si abondans RNA ba, pa gen pwodwi ki pral montre nan elektwoforèz, men sa pa vle di pa gen okenn pwodwi ki pral anplifye pa PCR. An jeneral, referans entèn ka itilize pou detekte cDNA. Si referans entèn la gen rezilta, bon jan kalite a nan cDNA ka fondamantalman garanti (nan kèk ka, si fragman nan jèn sib la twò lontan, ka gen eksepsyon).

2. Si gen yon jèn li te ye anplifye pa modèl sa a, li ka verifye pa premye yo nan jèn sa a. Anplifikasyon referans entèn la pa nesesèman vle di ke pa gen okenn pwoblèm ak cDNA. Paske referans entèn gen gwo abondans nan cDNA, li fasil pou anplifye. Si cDNA pasyèlman degrade pou plizyè rezon, nan pèspektiv pwobabilite, rezilta PCR nan jèn sib abondans ki ba yo pral afekte anpil. Pandan ke referans entèn la toujou wo nan abondans, anplifikasyon a ap pwobableman pa afekte.

Pasyèlman degrade nan RNA. Detekte entegrite ak pirifye nan RNA

Sa ki nan RNA nan diferan espès yo ka diferan, men an jeneral, ekstrè total RNA a ta dwe gen ladan de klè 28S ak 18S bann nan jèl elektwoforèz, ak klète nan bann ansyen yo ta dwe de fwa pi wo pase sa yo ki nan lèt la. Bann 5S endike ke RNA te degrade, ak klète li yo pwopòsyonèl ak degre nan degradasyon. Anplifikasyon nan siksè nan referans entèn pa vle di ke pa gen okenn pwoblèm ak RNA, paske referans entèn la se nan abondans segondè, RNA ka anplifye toutotan degradasyon an pa grav. OD la₂₆₀/ OD₂₈₀rapò nan pi RNA mezire pa spèktrofotomètr yo ta dwe ant 1.9 ak 2.1. Yon ti kantite enpurte pwoteyin nan RNA ap diminye rapò a. Osi lontan ke valè a pa twò ba, RT pa pral afekte. Sa ki pi enpòtan pou RT se entegrite RNA.

Ekstansyon jèn referans entèn la ka endike ke RT te reyisi, men li pa nesesèman gen rapò ak kalite strand cDNA a. Paske fragman referans entèn yo jeneralman ti nan gwosè ak segondè nan ekspresyon, yo pi fasil yo gen siksè nan transkripsyon ranvèse. Sepandan, gwosè a ak ekspresyon de jèn sib varye de jèn nan jèn. Bon jan kalite a cDNA pa ka jije sèlman pa referans entèn espesyalman pou fragman yo sib pi long pase 2 kb.

Gen kèk echantiyon ki gen estrikti konplèks segondè, oswa ki gen kontni GC rich, oswa yo koute chè ak abondans ki ba. Nan ka sa yo, yo ta dwe chwazi transkriptaz ranvèse apwopriye selon gwosè fragman sib la ak echantiyon an. Pou modèl RNA ak kontni segondè GC ak estrikti konplèks segondè, li difisil pou louvri estrikti segondè a nan tanperati ki ba, oswa avèk transkriptaz ranvèse komen. Pou modèl sa yo, yo ka chwazi Quant Reverse Transcriptase, depi pèfòmans transkripsyon ranvèse li yo evidamman pi bon pase sa yo ki nan seri M-MLV ranvèse transkriptaz, sa ki ka ranvèse transkri modèl RNA divès kalite avèk efikasite epi transkri RNA nan cDNA premye strand nan limit maksimòm lan. Lè w ap itilize twous jeneral transkriptaz ranvèse, 20 μl sistèm ka sèlman efektivman ranvèse transkri 1 μg nan RNA total. Tanpri peye atansyon sou kapasite maksimòm RT twous la. Si yo ajoute modèl la an plis, ranvèse transkripsyon ap favorize RNA a avèk anpil abondans. Se poutèt sa, li pi bon pa depase kapasite maksimòm sistèm lan.

A-1 Detèmine si RNA degrade grav epi si RT reyisi

An jeneral, rezon ki fè echèk la nan anplifikasyon referans entèn souvan ki te koze pa degradasyon RNA grav. Yon lòt rezon posib se ranvèse transkripsyon echèk. Entèn referans pa ka itilize kòm yon estanda jije bon jan kalite a nan cDNA sèl strand, men li ka itilize kòm yon estanda jije si ranvèse transkripsyon gen siksè si pa gen okenn pwoblèm nan bon jan kalite a RNA. Bagay ki pi enpòtan nan pwosesis transkripsyon ranvèse a se kenbe yon tanperati konstan ak yon sistèm reyaksyon konstan yo nan lòd yo amelyore efikasite nan reyaksyon.

A-2 Detèmine si primè yo pou anplifye jèn referans entèn yo serye epi si gen nenpòt pwoblèm avèk reyaktif yo itilize nan PCR.

Pou pwopòsyon relatif, RNA dwe quantifié anvan transkripsyon ranvèse, ki nesesè tou nan anpil twous transkripsyon ranvèse, pou egzanp, quantifier opinyon RNA a kòm 1 μg. Depi ranvèse transkri cDNA a se yon solisyon melanje, ki gen ladan RNA, oligo dT, anzim, dNTP, e menm yon ti kras rezidi ADN, yo pral devyasyon ki te koze, kidonk li enposib avèk presizyon quantifier cDNA la. Se poutèt sa, quantification RNA nesesè. Lè ou konsidere efikasite nan transkripsyon ranvèse se menm bagay la nan mitan echantiyon diferan, kantite lajan an nan cDNA jwenn yo ta dwe menm bagay la tou, ak analiz la quantitative ka montre konparezon a nan nivo ekspresyon nan jèn diferan nan menm kantite lajan an nan total RNA. Lè w ap fè relatif fluoresans PCR quantitative, quantitative cDNA pa ka oblije apre transkripsyon ranvèse paske jèn referans entèn la ka aji kòm referans.

Li se sitou ki gen rapò ak jèn yo, ak ranvèse transkripsyon nan fragman long se pa posib pou pifò jèn. Premyerman, efikasite nan transkripsyon ranvèse se byen lwen pi ba pase sa yo ki an PCR. Dezyèmman, rejyon an GC rich ak estrikti segondè nan jèn anpil mete restriksyon sou tou de ranvèse transkripsyon ak PCR. Finalman, fidelite ak efikasite anplifikasyon nan PCR yo difisil pou garanti an menm tan. Nan pwosesis la nan transkripsyon ranvèse, pesonn pa ka garanti yo ka resevwa long fragman pou jèn kopi ki ba, espesyalman lè l sèvi avèk oligo dT. Kòm pou 5 'UTR ki gen plis GC, li se menm pi difisil. Se poutèt sa, li se toujou yon metòd rezonab ranvèse transkripsyon ak prime o aza, jwenn sit yo klivaj natirèl nan fragman sib la, anplifye pa segments, ak Lè sa a, fè dijesyon an restriksyon ak ligasyon. An jeneral, li difisil pou dirèkteman anplifye fragman ki pi gwo pase 2 kb, men li pa toujou enposib pou jwenn: 1. Premyèman, garanti entegrite RNA / mRNA, epi ekstraksyon TRIZOL pi pito. 2. M-MLV RT-PCR twous ka dirèkteman itilize. Pwolonje tan rkwit epi ogmante kantite sik nan pwosesis anplifikasyon an byen. Altènativman, PCR enbrike ka aplike, oswa pote soti nan youn oubyen de reyaksyon premye ak denaturasyon ki apwopriye pwolonje ak tan ekstansyon anvan anplifikasyon PCR nòmal, ki ka ede pou yon ekstansyon pou fragman. Peye atansyon sou fidelite polimeraz la. 3. Long Taq ka itilize nan PCR pou jwenn rezilta ideyal. 4.Pou aplikasyon ekspresyon pwoteyin, yo ta dwe aplike segondè fidelite polymérase.

Gen de kalite transkriptaz ranvèse yo ofri nan TIANGEN: Quant / King RTase ak TIANScript M-MLV. Diferans prensipal la ant yo se kantite lajan opinyon nan modèl. Quant se yon transkriptaz ranvèse inik, ki diferan de souvan itilize M-MLV ki sòti nan viris lesemi Moloney murine. Quant se yon nouvo transkriptaz ranvèse segondè-efikasite recombinantly eksprime pa jeni Escherichia coli. Quant se apwopriye pou anplifye 50 ng-2 μg nan RNA ak aktivite ranvèse transkripsyon segondè ak segondè sede. Konpare ak òdinè MMLV oswa AMV, pi gwo karakteristik Quant a se ke li gen trè fò afinite ak modèl RNA epi li ka ranvèse modèl konplèks transkripsyon san denaturasyon tanperati ki wo. Pou modèl ki gen pi wo kontni GC, efikasite ranvèse a pi wo. Sepandan, transkriptaz ranvèse sa a gen aktivite RNase H, ki ka afekte longè pwodwi cDNA (apwopriye pou modèl <4.5 kb). Pou transkripsyon ranvèse konvansyonèl yo rekòmande transkriptaz ranvèse TIANScript MMLV. RTase sa a se yon anzim modifye ak aktivite RNase H trè fèb, ki apwopriye pou sentèz long (> 5 kb) cDNA.

Yon sèl etap transkripsyon ranvèse ak PCR anplifikasyon yo fini nan tib la menm san yo pa louvri kouvèti a tib ant sentèz cDNA ak anplifikasyon, ki se itil diminye kontaminasyon. Depi tout echantiyon cDNA jwenn yo itilize pou anplifikasyon, sansiblite a pi wo, ak yon minimòm de 0.01 pg nan RNA total. Pou siksè RTPCR yon sèl etap, jèn espesifik espesifik yo jeneralman itilize pou kòmanse sentèz cDNA. Metòd la de etap, sètadi ranvèse transkripsyon ak anplifikasyon PCR te pote soti nan de etap. Premyerman ranvèse transkripsyon te pote soti nan yon modèl RNA jwenn cDNA, epi yo jwenn cDNA a sibi youn oswa plis reyaksyon PCR diferan. Metòd de etap la ka itilize oligo (dT) oswa primè o aza pou gide sentèz premye strand cDNA a, epi li ka ranvèse transkri tout enfòmasyon mRNA ki soti nan yon echantiyon espesifik.