TIANSeq Single-Index adaptè (Illumina)

A pwezan, segondè-débit sekans teknoloji kesyon sa te poze baze sou pwochen jenerasyon sekans teknoloji. Kòm longè lekti teknoloji sekans pwochen jenerasyon an limite, nou dwe kraze sekans longè konplè an ti bibliyotèk fragman pou sekans. Dapre bezwen yo nan eksperyans sekans diferan, anjeneral nou chwazi sekans yon sèl-fini oswa sekans doub-fini. Kounye a fragman ADN nan pwochen jenerasyon sekans bibliyotèk la jeneralman distribiye nan seri 200-800 bp.

a) ADN pòv nan bon jan kalite e li gen inibitè. Sèvi ak echantiyon ADN-wo kalite pou fè pou evite anpèchman nan aktivite anzim.

b) Kantite echantiyon ADN ensifizan lè w ap itilize metòd PCR-gratis pou konstwi bibliyotèk ADN. Lè opinyon ADN fragman an depase 50 ng, workflow PCR-gratis ka selektivman te pote soti pandan pwosesis konstriksyon bibliyotèk la. Si nimewo kopi bibliyotèk la twò ba pou dirèkteman sekans, bibliyotèk ADN lan ka anplifye pa PCR apre ligasyon adaptè a.

c) RNA kontaminasyon mennen nan kòrèk premye quantification ADN kontaminasyon RNA ka egziste nan pwosesis la pou pirifye nan ADN jenomik, ki ka mennen nan kantite kòrèk ADN ak ensifizan loading ADN pandan konstriksyon bibliyotèk la. RNA ka retire nan trete ak RNase.

A-1

a) Ti fragman (60 bp-120 bp) parèt Ti fragman yo anjeneral fragman adaptè oswa dimè ki fòme pa adaptè. Pirifikasyon ak Agencourt AMPure XP pèl mayetik ka efektivman retire fragman sa yo adaptè epi asire bon jan kalite sekans.

b) Gwo fragman parèt nan bibliyotèk la apre anplifikasyon PCR Gwosè fragman ADN nan bibliyotèk la ap ogmante pa 120 bp apre adaptè a ligate. Si fragman ADN nan ogmante pa plis pase 120 bp apre ligasyon adaptè a, li ta ka koze pa anplifikasyon fragman nòmal nan anplifikasyon PCR twòp. Diminye kantite sik PCR ka anpeche sitiyasyon an.

c) Gwosè nòmal nan fragman ADN nan bibliyotèk apre ligatè adaptè Longè adaptè nan twous sa a se 60 bp. Lè de bout yo nan fragman an ligated nan cartes yo, longè a pral sèlman ogmante pa 120 bp. Lè ou sèvi ak yon adaptè ki pa sa yo bay nan twous sa a, tanpri kontakte founisè a bay enfòmasyon ki enpòtan tankou longè adaptè. Tanpri asire ke workflow eksperyans lan ak operasyon swiv etap ki dekri nan manyèl la.

d) Nòmal gwosè fragman ADN anvan ligasyon adaptè a Rezon ki fè pwoblèm sa a ka koze pa move kondisyon reyaksyon pandan fwagmantasyon ADN. Fwa reyaksyon diferan yo ta dwe itilize pou opinyon ADN diferan. Si opinyon ADN lan plis pase 10 ng, nou rekòmande pou chwazi tan reyaksyon 12 min kòm tan kòmanse pou optimize, ak gwosè fragman ki pwodui nan moman sa a sitou nan seri 300-500 bp. Itilizatè yo ka ogmante oswa diminye longè fragman ADN yo pou 2-4 min selon pwòp kondisyon yo pou optimize fragman ADN yo ak gwosè ki nesesè yo.

A-2

a) Tan fwagmantasyon pa optimize Si ADN fragmentasyon an twò piti oswa twò gwo, tanpri al gade Gid pou Seleksyon Tan fwagmantasyon yo bay nan enstriksyon an pou detèmine tan reyaksyon an, epi sèvi ak pwen tan sa a kòm yon kontwòl, anplis mete kanpe yon sistèm reyaksyon pou pwolonje oswa diminye 3 min pou fè ajisteman pi egzak sou tan fwagmantasyon.

A-3

Distribisyon gwosè nòmal nan ADN apre tretman fwagmantasyon

a) Metòd dekonjle kòrèk nan reyaktif fwagmantasyon, oswa reyaktif la pa konplètman melanje apre deglase. Deglase 5 × reyaksyon an fwagmantasyon anzim Mix sou glas. Yon fwa deglase, melanje reyaktif la respire pa dousman flicking pati anba a nan tib la. Pa toubiyon reyaktif la!

b) Echantiyon D 'ADN an gen EDTA oswa lòt polyan Epletion nan iyon sèl ak ajan kelat nan etap pirifikasyon ADN lan patikilyèman enpòtan pou siksè eksperyans lan. Si ADN fonn nan 1 × TE, itilize metòd yo bay nan enstriksyon an pou fè fwagmantasyon. Si konsantrasyon EDTA nan solisyon an ensèten, li rekòmande pou pirifye ADN lan epi fonn li nan dlo deyonize pou reyaksyon ki vin apre.

c) Kantite ADN kòrèk inisyal Gwosè ADN fragman an pre relasyon ak kantite D 'ADN. Anvan tretman fwagmantasyon, quantification egzat nan ADN lè l sèvi avèk Qubit, Picogreen ak lòt metòd esansyèl pou detèmine kantite egzak ADN nan sistèm reyaksyon an.

 d) Preparasyon sistèm reyaksyon an pa swiv enstriksyon yo. Preparasyon sistèm reyaksyon fragmentasyon an dwe fèt sou glas estrikteman dapre enstriksyon yo. Pou asire efè a pi byen, tout eleman reyaksyon yo ta dwe mete sou glas ak preparasyon an nan sistèm reyaksyon yo ta dwe te pote soti apre refwadisman konplè. Aprè preparasyon an fini, tanpri repwoche fim oswa pipèt melanje byen. Pa fè toubiyon!

1. Move metòd melanje (toubiyon, osilasyon vyolan, elatriye) ap lakòz distribisyon nòmal nan fragman bibliyotèk (jan yo montre nan figi sa a), konsa ki afekte bon jan kalite a nan bibliyotèk la. Se poutèt sa, lè w ap prepare solisyon an reyaksyon Fragmentation Mix, tanpri pipete dousman leve, li desann nan melanje, oswa itilize pwent dwèt la yo repwoche fim ak melanje respire. Fè atansyon pa melanje ak toubiyon.

2. Yo dwe itilize gwo pite ADN pou konstriksyon bibliyotèk la

■ Bon entegrite ADN: Gwoup elektwoforèz la gen plis pase 30 kb, san li pa taye

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Kantite D 'ADN dwe egzat Li sijere pou itilize metòd Qubit ak PicoGreen pou quantifier ADN, olye ke Nanodrop.

4. Kontni EDTA nan solisyon ADN dwe detèmine EDTA gen yon gwo enfliyans sou reyaksyon fwagmantasyon an. Si kontni EDTA a wo, pirifikasyon ADN bezwen fèt anvan tès ki vin apre a.

5. Solisyon reyaksyon fwagmantasyon an dwe prepare sou glas Pwosesis fwagmantasyon an sansib a tanperati ak tan reyaksyon (sitou apre ou fin ajoute améliorant). Yo nan lòd asire presizyon nan tan reyaksyon, tanpri prepare sistèm reyaksyon sou glas.

6. Tan reyaksyon fwagmantasyon an dwe egzat. Tan reyaksyon etap fwagmantasyon an pral afekte dirèkteman sou gwosè pwodwi fragman yo, konsa ki afekte distribisyon gwosè fragman ADN nan bibliyotèk la.

1. Ki kalite echantiyon ki aplikab a twous sa a?

Kalite echantiyon ki aplikab nan twous sa a ka total RNA oswa pirifye mRNA ak bon entegrite RNA. Si yo itilize RNA total pou konstwi bibliyotèk la, li rekòmande pou itilize twous rediksyon rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) pou retire rRNA an premye.

2. Èske yo ka itilize echantiyon FFPE pou konstwi bibliyotèk ak twous sa a?

MRNA nan echantiyon FFPE yo pral degrade nan yon sèten mezi, ak relatif entegrite pòv yo. Lè w ap itilize twous sa a pou konstriksyon bibliyotèk la, li rekòmande pou optimize tan fwagmantasyon an (diminye tan fwagmantasyon an oswa ou pa fè fwagmantasyon).

3. Sèvi ak etap la seleksyon gwosè yo bay nan manyèl la pwodwi, ki sa ki ka lakòz segman nan eleman parèt ti tay devyasyon?

Seleksyon Size dwe te pote soti nan akò strik ak etap la seleksyon gwosè nan manyèl sa a pwodwi. Si gen devyasyon, rezon ki fè yo ta ka ke pèl mayetik yo pa balanse nan tanperati chanm oswa yo pa konplètman melanje, pipèt la pa egzat oswa likid la rete nan pwent an. Li rekòmande yo sèvi ak konsèy yo ak adsorption ki ba pou eksperyans lan.

4. Seleksyon cartes nan konstriksyon bibliyotèk la

Twous konstriksyon bibliyotèk la pa gen reyaktif adaptè, epi li rekòmande pou itilize twous sa a ansanm ak adaptè Single-Index TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC nan bibliyotèk la

Bibliyotèk deteksyon quantitative: Qubit ak qPCR yo te itilize detèmine konsantrasyon an mas ak konsantrasyon molè nan bibliyotèk la respektivman. Operasyon an se entèdi an akò avèk manyèl pwodwi a. Konsantrasyon nan bibliyotèk la pral jeneralman satisfè kondisyon sekans NGS yo. Deteksyon ranje distribisyon bibliyotèk la: Sèvi ak Agilent 2100 Bioanalyzer pou detekte seri distribisyon bibliyotèk la.

6. Seleksyon nimewo sik anplifikasyon

Selon enstriksyon yo, kantite sik PCR se 6-12, epi kantite sik PCR ki nesesè yo ta dwe chwazi selon opinyon echantiyon an. Nan bibliyotèk segondè-sede, sou anplifikasyon anjeneral rive nan diferan degre, ki se manifeste pa yon pik yon ti kras pi gwo apre pik la nan seri a sib nan deteksyon an nan Agilent 2100 Bioanalyzer, oswa konsantrasyon nan detekte nan Qubit se pi ba pase sa yo ki an qPCR. Ti sou anplifikasyon se yon fenomèn nòmal, ki pa afekte sekans bibliyotèk ak analiz done ki vin apre.

7. Spikes parèt nan pwofil deteksyon Agilent 2100 Bioanalyzer

Aparans nan Spikes nan deteksyon Agilent 2100 Bioanalyzer se paske nan fwagmantasyon nan inegal nan echantiyon, kote pral gen plis fragman nan sèten gwosè, ak sa a ap vin pi evidan apre anrichi PCR. Nan ka sa a, li sijere pa fè seleksyon an gwosè, sa vle di mete kondisyon an fwagmantasyon a 94 ° C pou 15 min enkubat, kote distribisyon an fragman se ti ak konsantre, ak omojèn lan ka amelyore.