2 × Pfu PCR Mix

A-1 Modèl

■ Modèl la gen enpurte pwoteyin oswa inhibiteur Taq, elatriye ——Pire modèl ADN, retire enpurte pwoteyin oswa ekstrè ADN modèl avèk twous pirifikasyon.

■ Denaturasyon modèl la pa konplè ——Ki apwopriye ogmante tanperati denaturasyon ak prolonje tan denaturasyon.

■ Degradasyon Modèl —— Re-prepare modèl la.

A-2 Jadendanfan

■ Kalite pòv nan Jadendanfan -— Re-sentetiz Jadendanfan an.

■ Primè degradasyon ——Aliquot prime konsantrasyon segondè yo nan ti volim pou prezèvasyon. Evite konjelasyon miltip ak dekonjle oswa alontèm 4 ° C kriokonsèvasyon.

■ Konsepsyon move nan prime (egzanp longè Jadendanfan pa ase, dimè ki te fòme ant Jadendanfan, elatriye) -Reba konsepsyon (evite fòmasyon jadendanfan ak estrikti segondè)

A-3 Mg²⁺konsantrasyon

■ Mg²⁺ konsantrasyon twò ba ——Byen ogmante Mg²⁺ konsantrasyon: Optimize Mg la²⁺ konsantrasyon pa yon seri de reyaksyon soti nan 1 mM a 3 mM ak yon entèval nan 0.5 mM detèmine Mg nan pi bon²⁺ konsantrasyon pou chak modèl ak Jadendanfan.

A-4 tanperati rkwit

■ Tanperati a wo rkwit afekte obligatwa nan Jadendanfan ak modèl. ——Diminye tanperati a annealing ak optimize kondisyon an ak yon gradyan nan 2 ° C.

A-5 ekstansyon tan

■ Kout tan ekstansyon —— Ogmante tan ekstansyon.

Fenomèn: echantiyon negatif montre tou bann sekans sib yo.

A-1 Kontaminasyon nan PCR

■ Kwa kontaminasyon nan sekans sib oswa pwodwi anplifikasyon —— Ak anpil atansyon pa pipet echantiyon an ki gen sekans sib nan echantiyon negatif la oswa gaye yo soti nan tib la santrifujeur. Reyaktif yo oswa ekipman yo ta dwe otoklave pou elimine asid nikleyè ki deja egziste yo, epi egzistans kontaminasyon yo ta dwe detèmine nan eksperyans kontwòl negatif.

■ Kontaminasyon reyaktif ——Aliquot reyaktif yo epi estoke nan tanperati ki ba.

A-2 Pwemyer

■ Mg²⁺ konsantrasyon twò ba ——Byen ogmante Mg²⁺ konsantrasyon: Optimize Mg la²⁺ konsantrasyon pa yon seri de reyaksyon soti nan 1 mM a 3 mM ak yon entèval nan 0.5 mM detèmine Mg nan pi bon²⁺ konsantrasyon pou chak modèl ak Jadendanfan.

■ Move konsepsyon Jadendanfan, ak sekans sib la gen omoloji ak sekans ki pa sib la. —— Re-konsepsyon primè.

Fenomèn: Gwoup yo anplifikasyon PCR yo konsistan avèk gwosè a espere, swa gwo oswa piti, oswa pafwa tou de bann anplifikasyon espesifik ak bann anplifikasyon ki pa espesifik rive.

A-1 Jadendanfan

■ Pòv espesifik Jadendanfan

—— Re-konsepsyon Jadendanfan.

■ Konsantrasyon Jadendanfan an twò wo —— Byen ogmante tanperati denaturasyon an epi prolonje tan denaturasyon an.

A-2 Mg²⁺ konsantrasyon

■ Mg la²⁺ konsantrasyon twò wo ——Byen diminye konsantrasyon Mg2 +: Optimize Mg la²⁺ konsantrasyon pa yon seri de reyaksyon soti nan 1 mM a 3 mM ak yon entèval nan 0.5 mM detèmine Mg nan pi bon²⁺ konsantrasyon pou chak modèl ak Jadendanfan.

A-3 polimeraz tèrmabl

■ Kantite twòp anzim ——Redwi kantite anzim kòmsadwa nan entèval 0.5 U.

A-4 tanperati rkwit

■ Tanperati rkwit la twò ba ——Apropreman ogmante tanperati rkwit la oswa adopte metòd rkwit de-etap la

A-5 sik PCR

■ Twòp sik PCR —— Diminye kantite sik PCR.

A-1 Jadendanfan——Pòv espesifik ——Re-konsepsyon Jadendanfan a, chanje pozisyon an ak longè Jadendanfan a amelyore espesifik li yo; oswa fè PCR enbrike.

A-2 Modèl ADN

—— Modèl la pa pi ——Pirifye modèl la oswa ekstrè ADN avèk twous pirifikasyon.

A-3 Mg²⁺ konsantrasyon

——Mg²⁺ konsantrasyon twò wo ——Byen diminye Mg²⁺ konsantrasyon: Optimize Mg la²⁺ konsantrasyon pa yon seri de reyaksyon soti nan 1 mM a 3 mM ak yon entèval nan 0.5 mM detèmine Mg nan pi bon²⁺ konsantrasyon pou chak modèl ak Jadendanfan.

A-4 dNTP

—— Konsantrasyon dNTP yo twò wo —— Diminye konsantrasyon dNTP kòmsadwa

A-5 tanperati rkwit

——Tan ba tanperati rkwit ——Apropreman ogmante tanperati rkwit la

A-6 sik

——Twòp sik ——Optimize nimewo sik la

Premye etap la se yo chwazi polimeraz ki apwopriye a. Regilye polimeraz Taq pa ka koreksyon akòz mank de aktivite exonuclease 3'-5 ', ak dezekilib pral redwi anpil efikasite nan ekstansyon nan fragman. Se poutèt sa, regilye Taq polimeraz pa ka efektivman anplifye fragman sib ki pi gran pase 5 kb. Taq polymérase ak modifikasyon espesyal oswa lòt segondè fidelity polymérase yo ta dwe chwazi amelyore efikasite ekstansyon ak satisfè bezwen yo nan anplifikasyon fragman long. Anplis de sa, anplifikasyon nan fragman long mande tou pou ajisteman korespondan nan konsepsyon Jadendanfan, tan denaturasyon, tan ekstansyon, tanpon pH, elatriye Anjeneral, Jadendanfan ak 18-24 bp ka mennen nan pi bon sede. Yo nan lòd yo anpeche domaj modèl, tan an denaturasyon nan 94 ° C yo ta dwe redwi a 30 sec oswa mwens pou chak sik, ak tan nan monte tanperati a 94 ° C anvan anplifikasyon yo ta dwe mwens pase 1 min. Anplis, mete tanperati a ekstansyon nan apeprè 68 ° C ak desine tan an ekstansyon selon pousantaj la 1 kb / min ka asire anplifikasyon efikas nan fragman long.

Pousantaj nan erè nan anplifikasyon PCR ka redwi lè l sèvi avèk divès kalite ADN polymerases ak fidelite segondè. Pami tout polimeraz ADN Taq yo jwenn twò lwen, Pfu anzim gen to erè ki pi ba a ak fidelite ki pi wo a (gade tablo ki tache). Anplis de sa nan seleksyon anzim, chèchè yo ka plis redwi pousantaj mitasyon PCR pa optimize kondisyon reyaksyon, ki gen ladan optimize konpozisyon tanpon, konsantrasyon nan polimeraz tèrmostab ak optimize nimewo sik PCR.